Reação de hemi-nested RT-PCR dirigida ao gene da hemaglutinina-esterase do Coronavírus Bovino
Coronavírus bovino, RT-PCR, Hemaglutinina-esterase, diversidade genética
O coronavírus bovino (BCoV) é um vírus RNA simples fita, de sentido positivo, não segmentado com envelope constituído de uma camada dupla de lipídios com quatro proteínas (HE, S, E e M) que resultam no aspecto de coroa dos vírions. Como a HE (hemaglutinina-esterase) é uma proteína polimórfica com uma função de receptor aglutinante secundária, estudos sobre a diversidade do gene HE podem possibilitar maiores informações sobre a evolução e interação hospedeiro-parasita do BCoV. Uma reação de hemi-nested RT-PCR foi desenvolvida para a amplificação de um produto de 441pb do gene HE do BCoV (nt 543 ao 562). Temperaturas ótimas de hibridização foram testadas em um termociclador com gradiente para a reação de hemi-nested e utilizada no protocolo final. A sensibilidade analítica foi determinada por meio da diluição serial na base 10 do BCoV amostra Kakegawa (título HA: 256) em uma suspensão fecal negativa para BCoV, resultando positiva até a diluição de 10-6, mostrando uma alta sensibilidade analítica sem inibição na PCR. O protocolo final da hemi-nested RT-PCR foi aplicado a 21 amostras fecais de vacas previamente positivas para BCoV e o sequenciamento de DNA do produto de 441pb de 14 amostras resultaram em sequências com elevado escore do gene HE do BCoV após a análise no BLAST/n. Essa hemi-nested RT-PCR é uma ferramenta poderosa para estudos de diversidade filogenética de linhagens de campo de BCoV e para estudos comparativos entre os diferentes genes dos Coronavírus.
Sibele Pinheiro de Souza, Karen Miyuki Asano, Laura Yaneth Villarreal Buitrago, Sheila de Oliveira Souza Silva, Leonardo José Richtzenhain, Paulo Eduardo Brandão
Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science