Reação de hemi-nested RT-PCR dirigida ao gene da hemaglutinina-esterase do Coronavírus Bovino
subject: Coronavírus bovino, RT-PCR, Hemaglutinina-esterase, diversidade genética
description: O coronavírus bovino (BCoV) é um vírus RNA simples fita, de sentido positivo, não segmentado com envelope constituído de uma camada dupla de lipídios com quatro proteínas (HE, S, E e M) que resultam no aspecto de coroa dos vírions. Como a HE (hemaglutinina-esterase) é uma proteína polimórfica com uma função de receptor aglutinante secundária, estudos sobre a diversidade do gene HE podem possibilitar maiores informações sobre a evolução e interação hospedeiro-parasita do BCoV. Uma reação de hemi-nested RT-PCR foi desenvolvida para a amplificação de um produto de 441pb do gene HE do BCoV (nt 543 ao 562). Temperaturas ótimas de hibridização foram testadas em um termociclador com gradiente para a reação de hemi-nested e utilizada no protocolo final. A sensibilidade analítica foi determinada por meio da diluição serial na base 10 do BCoV amostra Kakegawa (título HA: 256) em uma suspensão fecal negativa para BCoV, resultando positiva até a diluição de 10-6, mostrando uma alta sensibilidade analítica sem inibição na PCR. O protocolo final da hemi-nested RT-PCR foi aplicado a 21 amostras fecais de vacas previamente positivas para BCoV e o sequenciamento de DNA do produto de 441pb de 14 amostras resultaram em sequências com elevado escore do gene HE do BCoV após a análise no BLAST/n. Essa hemi-nested RT-PCR é uma ferramenta poderosa para estudos de diversidade filogenética de linhagens de campo de BCoV e para estudos comparativos entre os diferentes genes dos Coronavírus.
creator: Sibele Pinheiro de Souza, Karen Miyuki Asano, Laura Yaneth Villarreal Buitrago, Sheila de Oliveira Souza Silva, Leonardo José Richtzenhain, Paulo Eduardo Brandão
source: Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science
publisher: Universidade de São Paulo
date: 2010
language: EN, PT
identifier: DOI: 10.11606/issn.1678-4456.bjvras.2010.26832
coverage: Animal culture